透析还是脱盐？选择一种蛋白质纯化方法 作者：实验室生活团队 | 发布日期：2024年3月22日 作者：Halina Zakowicz 博士 选择蛋白质纯化方法的指南和决策树   目录 蛋白质纯化方法介绍 什么是蛋白质样品脱盐？ 蛋白质脱盐的优点 蛋白质脱盐的缺点 什么是蛋白质样品透析？ 蛋白质透析的优点 蛋白质透析的缺点 何时使用脱盐进行蛋白质分析 何时使用透析进行蛋白质分析 更多关于蛋白质纯化方法的工具和资源 蛋白质样品脱盐和蛋白质样品透析是两种常用的蛋白质纯化方法，用于样品制备。虽然它们都旨在从目标蛋白质样品中去除小分子或不需要的物质，但它们在作用机制和操作原理上有所不同。 何时使用脱盐与透析取决于几个因素，包括时间、样品量、所需的纯度水平、样品纯化方法、蛋白质类型以及不需要分子的尺寸和分子量。 什么是蛋白质脱盐？ 蛋白质脱盐是一种常用的技术，用于从蛋白质样品中去除盐和其他小分子。该技术通常使用尺寸排阻色谱（SEC）柱或装有树脂的脱盐离心柱进行。样品加载到色谱柱上后，盐分子会因其不同的分子量和尺寸在树脂中移动时与蛋白质分离。目标蛋白质在单独的组分中收集，不含盐和其他小分子。 图1. 脱盐柱 脱盐柱（图1）依赖于凝胶过滤色谱法，也称为尺寸排阻色谱法（SEC），其中不同的分子量截留（MWCO）限制根据尺寸排除分子。这个过程类似于分子筛。当匹配正确时，目标大分子因尺寸过大而无法进入树脂孔隙，并迅速通过色谱柱。 相反，缓冲盐和其他小分子进入树脂孔隙，这会减慢它们在树脂床中的迁移速度。较快的大分子与较慢的小分子分离。从色谱柱流出的不同组分被收集起来，感兴趣的大分子可以与随后从小分子中分离出来。这段视频展示了树脂基脱盐柱如何进行蛋白质脱盐。 蛋白质脱盐的优缺点 蛋白质脱盐的优点： 去除不需要的盐 适用于各种样品体积 操作简单快捷 兼容有机溶剂和其他溶剂 将污染物浓缩到相对较小的体积（适用于处理有毒/放射性物质） 蛋白质脱盐的缺点： 样品输入体积有限 蛋白质性质可能改变 什么是蛋白质透析？ 蛋白质样品透析是一种用于交换缓冲液或从蛋白质样品中去除不需要的分子的技术。透析涉及将蛋白质样品放入选择性渗透膜或透析管中，并将其浸入缓冲溶液中。透析膜允许小分子（如盐或污染物）从样品中扩散出去，同时保留蛋白质。此过程允许交换缓冲液和去除不需要的物质，从而获得纯化的蛋白质样品。 图2. 透析膜的工作原理。透析膜是一种半透膜（通常是再生纤维素薄片），含有各种大小的孔隙。大于孔隙的分子无法通过膜，但小分子可以自由通过。通过这种方式，透析可用于对含有大分子的样品进行纯化或缓冲液交换。 蛋白质透析的优缺点 蛋白质透析的优点： 有效去除小分子。 保持蛋白质完整性。 适用于多种样品体积。 兼容多种缓冲体系 蛋白质透析的缺点： 耗时过程。 蛋白质损失风险。 重复使用膜时可能发生膜堵塞 何时使用脱盐进行蛋白质纯化和分析 主要用途：去除干扰性盐 如果您的蛋白质样品含有高浓度盐，这些盐可能会干扰下游蛋白质分析技术，如蛋白质定量、凝胶电泳、质谱或酶学测定，则可以进行脱盐以去除这些盐，提高分析的准确性和可靠性。…

赛默飞世尔科技 分类 材料进展 采矿进展 AnalyteGuru 金属分析 问科学家 实验室幕后 规模化生物技术 临床对话 食品检测 识别威胁 揭示半导体 原子分辨率下的生命 实验室生活 OEMpowered 互联实验室 关于我们 联系方式 加速科学实验室生活 / 通用 / 成功提取RNA的14个技巧 成功提取RNA的14个技巧 作者： 实验室生活团队 | 发布日期： 2021年11月5日 即使是最有经验的分子生物学家，在RNA提取过程中也曾忍不住大声咒骂。对于非科学家来说，这可能看起来像是一个可怜的人正在失控，对着一根装满清澈、无名液体的无辜试管大喊大叫。 但对于那些经历过RNA提取诸多困境的科学家来说，很容易产生共鸣。怒气（也被称为“RNA怒”，RNAnger）是处理RNA时自然且常见的副作用。这可以理解：提取产量低和RNA降解即使对资深科学家也可能发生。 从各类样本中获取高质量RNA已成为许多实验方案的基础部分，包括下一代测序（NGS）、定量实时PCR（qRT-PCR）、Northern印迹和cDNA合成，许多科学家 routinely 执行此操作。低质量的RNA会严重影响下游分析，导致时间和金钱的损失。 但情况并非必须如此。许多RNA提取问题都可以避免和克服。为了助您在RNA提取的征程上取得胜利，我们提供了14个技巧，助您将“RNA怒”转化为“RNA智慧”（RNAccumen）。 选择正确的RNA分离试剂盒 市面上有许多用于RNA提取的试剂盒和试剂。但某些方案或形式可能更适合您的目标。请对每种试剂盒或试剂进行仔细研究，并考虑您将从中提取RNA的样本类型、该样本的起始量、您的下游分析方法、所需的通量以及您正在分析的RNA类型。 例如，如果您需要一种高通量的总RNA纯化方法，那么您可能需要考虑可扩展的MagMAX™ 试剂盒，而不是TRIzol RNA提取。但如果您样本量较少，并且想要使用一种高质量RNA的“金标准”方法，您很可能每次都会选择TRIzol。 注意起始样本量 多不总是好。大多数RNA分离试剂盒和试剂都提供了特定样本类型的推荐起始材料量。添加超过推荐量可能会抑制有效的裂解或RNA与其他细胞组分的分离。对于基于柱的方案，您可能会使吸附柱的结合能力过载，从而降低总产量。 请注意，不同动物组织中的RNA含量可能差异很大：心脏和肌肉细胞的总RNA量少于脾脏和胸腺细胞，后者通常富含核酸。这些组织还可能引入其他干扰因素，这可能使提取复杂化，并且可能需要修改方案才能提取高质量的RNA。 创建一个无RNase的环境 RNase？没听说过它们，对吧？ 它们是您RNA提取的头号敌人。它们很难被灭活或清除。RNase A家族中的RNase由多个二硫键稳定，即使在变性后也能保持活性。1,2 为了减少RNA提取过程中RNase意外引入的风险，请创建一个无RNase的操作台圣地。这可以是您工作台的一部分，用胶带划定，与您进行DNA或蛋白质提取的区域分开。将专用于RNA提取工作的试剂、耗材、移液器和手套放在此区域。 穿戴个人防护设备（PPE） 您是RNase的主要来源。您的汗液和皮肤油脂是RNase污染的丰富来源。3,4因此，戴手套以防止手部污染至关重要。如果您不小心用您戴的手套触摸了可能含有RNase的表面（例如门把手、您的脸部或您创建的无RNase区域以外的其他表面），请务必更换手套。您还可以穿实验服，以确保您的皮肤其他部分不会接触到样本。 使用无RNase的试剂和耗材 与上述观点一致，您还可以购买清洁产品、耗材和其他试剂，这些有助于抑制RNase，确保它们不会靠近您的RNA。表面去污溶液有助于从玻璃器皿、台面和移液器中去除RNase。 您可能会认为所有试管和移液器吸头在开箱时都是无RNase的，但许多在制造过程中可能已经引入了RNase。请确保您的耗材经过无RNase认证，并且您使用带滤芯的吸头，以防止移液器吸头或交叉样本污染。 RNaseZap和实验室清洁剂有助于维持无RNase实验室…

赛默飞世尔科技 类别 材料进展 采矿进展 AnalyteGuru 金属分析 问科学家 实验室幕后 规模化生物技术 临床对话 食品检测 识别威胁 揭示半导体 原子分辨率下的生命 实验室生活 OEM赋能 互联实验室 关于我们 联系方式 加速科学实验室生活 / 通用 / ELISA 与 Western Blot：何时使用哪种免疫分析技术 ELISA 与 Western Blot：何时使用哪种免疫分析技术 作者：实验室生活团队 | 发布日期：2024年1月11日   目录 引言 什么是 ELISA？ ELISA 的优点 ELISA 的缺点 什么是 Western Blot？ Western Blot 的优点 Western Blot 的缺点 何时使用 ELISA 进行蛋白质分析…

在细胞生物学领域，营养环境是维持强大细胞培养的关键。在这些必需营养素中，谷氨酰胺是一种关键的氨基酸，为众多的细胞过程提供能量。无论您是研究人员还是科学爱好者，了解谷氨酰胺的作用都能为细胞代谢和实验优化提供宝贵的见解。在这篇博文中，我们将深入探讨谷氨酰胺背后的科学，它在细胞培养中的关键功能，以及如何帮助确保您的细胞获得这种重要营养素最稳定的形式。加入我们，共同探索谷氨酰胺在细胞健康和研究中不可或缺的作用。 1. 什么是谷氨酰胺？ 谷氨酰胺是一种非必需氨基酸，在各种代谢过程中起着关键作用。它是人体中最丰富的游离氨基酸，除了蛋白质合成外，还参与许多生理功能。谷氨酰胺作为氮供体，对于核苷酸、氨基糖和其他氨基酸的合成至关重要。它还在柠檬酸循环中作为碳源，有助于细胞能量的产生。在大脑中，谷氨酰胺是谷氨酸和GABA等神经递质的前体，影响神经功能。 2. L-谷氨酰胺有什么作用？ L-谷氨酰胺是谷氨酰胺的L-异构体，具有生物活性，对多种细胞功能至关重要。它是蛋白质和核苷酸合成的关键底物，支持细胞生长和分裂。L-谷氨酰胺还通过促进谷胱甘肽（一种主要抗氧化剂）的合成，对维持细胞内的氧化还原平衡至关重要。在快速分裂的细胞中，如免疫系统和肠上皮细胞，L-谷氨酰胺是主要的能量来源。因此，它支持肠道粘膜的完整性并增强免疫细胞功能，使其对整体细胞健康和体内平衡不可或缺。 3. 为什么细胞培养基中含有L-谷氨酰胺？ 在细胞培养中，L-谷氨酰胺是一种必需的补充剂，因为它为细胞增殖和维持提供了必要的营养。培养细胞依赖L-谷氨酰胺合成蛋白质、核苷酸和其他关键生物分子。它在培养基中的存在确保细胞持续供应这种不可或缺的氨基酸，从而支持其能量代谢和生长。如果没有足够的L-谷氨酰胺，细胞可能会表现出活力下降、生长速度减慢以及执行基本功能的能力减弱，从而损害实验结果的完整性。 4. L-谷氨酰胺会在完全培养基中降解吗？ 是的，L-谷氨酰胺在完全培养基中会随着时间降解。在水溶液中，特别是在生理温度（37°C）下，L-谷氨酰胺会自发分解成氨和吡咯烷酮羧酸（图1）。这种降解不仅降低了L-谷氨酰胺的可用性，还会导致氨的积累，而氨对细胞有毒。高氨水平会改变培养基的pH值，对细胞代谢产生负面影响，并损害蛋白质糖基化，导致细胞生长和功能不佳。 图1. L-谷氨酰胺自发分解为氨和吡咯烷酮羧酸，其速率取决于pH值和温度。 5. 如何为我的细胞提供稳定的L-谷氨酰胺？ 为了减轻L-谷氨酰胺在细胞培养基中的不稳定性，研究人员可以使用这种氨基酸的稳定形式。一个有效的解决方案是Gibco™ GlutaMAX™ 补给品，它含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，一种L-谷氨酰胺的二肽形式。这种稳定形式可抵抗降解，并显著减少氨的产生，即使在37°C下长时间培养也是如此（图2）。 图2. A) 在37°C的培养基中，L-谷氨酰胺的降解速度快于GlutaMAX补给品。用GlutaMAX补给品或L-谷氨酰胺补充DMEM，分装到小瓶中，并在37°C下储存。每天取样并在-20°C下冷冻。GlutaMAX补给品和L-谷氨酰胺的水平通过HPLC测定。B) 补充培养基中的氨水平。 用GlutaMAX补给品或L-谷氨酰胺补充DMEM，分装到小瓶中，并在37°C下储存。每天取样并在-20°C下冷冻。氨的水平通过HPLC测定。   当细胞需要L-谷氨酰胺时，它们能够通过酶促作用将稳定的二肽分解成单独的L-谷氨酰胺和L-丙氨酸形式，然后将其代谢以用于它们支持的众多途径和功能（图3）。使用GlutaMAX补给品可以增强细胞培养基的稳定性，确保一致的细胞性能，并延长培养物的活力，从而优化实验结果。 图3. GlutaMAX补给品允许将L-谷氨酰胺从培养基受控地递送到培养中的细胞。   总之，了解L-谷氨酰胺在细胞培养中的作用和稳定性对于优化细胞生长和实验结果至关重要。通过选择GlutaMAX补给品等稳定替代品，研究人员可以帮助确保更健康、更高效的细胞培养。有关如何使用含GlutaMAX补给品的培养基最大化细胞培养的更多信息，请访问 thermofisher.com/glutamax。 相关内容： 使用Gibco培养基选择工具查找GlutaMAX培养基 使用细胞培养选择工具搜索您感兴趣的细胞系，查找细胞培养资源和建议 了解更多关于我们的培养基、FBS和塑料如何经过验证以实现卓越产品性能，以便您可以自信地进行培养。 来源： Yoo HC, Yu YC, Sung Y, Han JM. 细胞代谢中对谷氨酰胺的依赖性。Exp Mol Med. 2020年9月;52(9):1496-1516。doi: 10.1038/s12276-020-00504-8。Epub 2020年9月17日。PMID: 32943735; PMCID: PMC8080614。 Gibco GlutaMAX补给品手册 分享本文…

在培养细胞时有几点需要牢记，并且将一些简单的实践方法融入您的细胞培养过程可确保您获得可靠且一致的结果。这包括从了解如何选择培养基，到实施验证细胞系的程序。 培养基是稳定性的关键 您培养细胞所用的培养基可以说是培养成功的关键组成部分。有三种主要类型的培养基；基础培养基、低血清培养基和无血清培养基，每种的最佳实践略有不同。然而，为获得最佳性能需要注意的常见事项包括：保持正确的pH值，避免反复冻融（基础培养基不需要冷冻，最好冷藏），保护培养基免受光照，并尽量缩短在37°C下的加热时间。所有这些因素都可能影响培养基中化合物的稳定性，进而降低培养质量。 储存解决方案 您很可能在某个时候需要保存细胞以备将来使用。由于细胞极其脆弱且对环境变化敏感，因此在细胞的冻融过程中，确保您有一个经过验证的方案至关重要。使用含冷冻保护剂的冷冻保存培养基冷冻细胞并分装成小份以避免反复冻融——这可能会对细胞活力产生不利影响并造成细胞损伤。冻融的速度也至关重要。这可能因细胞类型而异，但一个好的经验法则是以每分钟1°C的速度冷冻，让细胞在冷冻时缓慢排出水分。解冻时，请确保将细胞放入预热的培养基中，使其迅速适应环境。 别忘了验证 惊人的20-30%的细胞系存在某种形式的交叉污染。因此，对您的细胞系进行验证测试以确认其身份并确保其不含污染物至关重要。有几种不同的验证方法：您可以选择简单地检查细胞形态在显微镜下观察是否存在不一致，或者进行更深入的分析，例如生长曲线、染色体或物种特异性线粒体DNA检测。如果您正在使用人类细胞系，短串联重复序列 (STR) 分析特别有用，因为您可以使用现有数据库来确定细胞的身份。 尽管细胞培养有许多方面需要考虑，但花时间了解并选择最适合您细胞培养过程的方法，将使您确信您的细胞能为成功的科学发现提供 基础。 了解更多 Gibco、Invitrogen 和 Nunc 细胞培养产品经过优化和评估，可帮助您在细胞培养研究的几乎任何阶段提高生产力。 了解我们的培养基、FBS（血清）和塑料如何协同验证，帮助您自信地使用赛默飞世尔科技培养细胞。 了解更多信息，请访问thermofisher.com/culturewithconfidence 分享此文章 FacebookTwitterPinterestTumblr

抗体药物偶联物101：“智能炸弹”助力癌症及其他疾病治疗 Written by Dana D’Amico | Published: 06.26.2025 Reviewed by Arjen Van den Berg 想象一下一种能够精确靶向癌细胞，同时相对不伤害健康细胞的制导导弹。这就是抗体药物偶联物（ADCs）的基本理念。这些引人入胜的分子正成为医学领域的一股主要力量，特别是在抗癌方面，而且这是一个快速发展的领域。 ADC市场充满活力。最初只是一个小众领域，现在已发展成为一个价值数十亿美元的产业，并且预计将继续增长。原因何在？因为ADCs在治疗各种癌症方面展现出真正的希望，从乳腺癌、淋巴瘤到白血病。将强大的化疗药物直接递送至癌细胞，同时最大限度地减少传统化疗可能引起的严重副作用，这是一项颠覆性的进展。 探索ADC发现资源 目录 什么是抗体药物偶联物（ADC）？ 类比科学：ADC作为对抗疾病靶点的“智能炸弹” ADC疗法组成部分 单克隆抗体（mAb） 连接子 细胞毒性载荷 双载荷ADC ADC如何作用？ 作用机制一览 ADC开发与生产工具 优化ADC工作流程的工具 FDA批准的ADC药物 2025年监管格局 ADC的未来 更多资源 什么是抗体药物偶联物（ADC）？ 抗体药物偶联物（ADC）是一种靶向癌症疗法，它将单克隆抗体的特异性与细胞毒性药物的效力相结合。这种方法能够将化疗药物直接递送至癌细胞，最大限度地减少对健康组织的损害。 类比科学：ADC作为对抗疾病靶点的“智能炸弹” 从科学角度来看，ADC是生物疗法中不同概念的巧妙结合。 首先是抗体，它就像一个归巢装置，专门识别癌细胞或其他疾病靶点上的抗原标记。然后，你有一个强效药物作为“弹头”，旨在杀死这些细胞。两者之间关键的分子连接被称为连接子。 科学家们正在不断研发对癌症更具特异性的更优抗体，开发更强大、更有针对性的药物，并创造在血液中稳定但在到达肿瘤后能释放载荷的连接子。我们正在看到新的方法，例如使用可靶向癌细胞上多个标记的双特异性抗体，或携带不同类型药物的抗体，如那些能增强患者自身免疫系统的药物。 ADC疗法组成部分 从结构上看，一个ADC由三个部分组成：一个与肿瘤相关抗原结合的单克隆抗体、一个细胞毒性载荷以及一个连接两者的化学连接子。抗体靶向癌细胞上过表达的抗原，确保选择性递送。 单克隆抗体（mAb） 单克隆抗体作为靶向部分，经过工程改造，能识别并结合在肿瘤细胞上过表达而在正常组织中极少存在的特定抗原。这种特异性有助于将细胞毒性载荷选择性地递送至恶性细胞，从而提高治疗效果，同时降低全身毒性。 连接子 连接子是一种将单克隆抗体（mAb）与细胞毒性载荷连接起来的化学桥。它必须在血液中稳定，以防止药物过早释放，但在靶细胞内可裂解，以确保有效的载荷递送。连接子分为可裂解和不可裂解两类。可裂解连接子利用细胞内条件（如酸性pH或特定酶如组织蛋白酶）来释放载荷，而不可裂解连接子则依赖于抗体在溶酶体内的完全降解来释放活性药物。 细胞毒性载荷 细胞毒性载荷是一种高效的小分子药物，旨在被内化后杀死癌细胞。常见的载荷包括微管抑制剂（如单甲基澳瑞他汀E）和DNA损伤剂（如卡利奇霉素）。由于其高毒性，这些药物不适合全身给药，但通过ADC选择性递送时则有效。 双载荷ADC ADC技术的一个新兴进展是双载荷ADC的开发，它在一个偶联物中包含了两种不同的细胞毒性药物。这一策略旨在通过同时靶向多个细胞通路来解决肿瘤异质性和耐药性问题。双载荷ADC可以设计成递送作用机制互补的药物，从而可能增强抗肿瘤活性并克服对单一药物疗法的抵抗。 ADC如何作用？ 一旦与靶抗原结合，ADC通过受体介导的内吞作用被内化到癌细胞中。内化的复合物被转运至溶酶体，连接子在此处被裂解，释放出细胞毒性药物。 抗体-药物偶联物的内化过程。 抗体-药物偶联物（ADC）由靶向肿瘤细胞抗原的单克隆抗体与小分子细胞毒性药物偶联而成。ADC旨在特异性结合靶细胞，并被迅速内化。通常，药物在转运至溶酶体后被释放，从而形成一种高度靶向的化疗药物。 在溶酶体内，连接子在控制细胞毒性载荷释放方面起着关键作用。连接子被设计为在循环中稳定，但在细胞内环境中可裂解，通常利用酸性pH或特定的溶酶体酶。例如，对组织蛋白酶B敏感的肽基连接子常被使用，确保细胞毒性剂主要在靶细胞的溶酶体内释放。 一旦释放，细胞毒性载荷会干扰关键的细胞过程，如DNA复制或微管功能，从而导致癌细胞死亡。一些ADC还表现出“旁观者效应”，即释放的药物扩散到邻近的肿瘤细胞中，包括那些缺乏靶抗原的细胞。这种旁观者现象在治疗异质性肿瘤时特别有益，因为并非所有细胞都均匀表达靶抗原。…

设计有效的CRISPR实验涉及多个步骤，其中之一是单向导RNA (sgRNA) 的有效设计。sgRNA是可编程序列，引导核酸酶（如CRISPR-Cas9）到达特定的DNA靶点。高效的sgRNA设计对于执行精确的基因组编辑实验至关重要。 为什么sgRNA设计很重要？ 为了优化sgRNA设计，应考虑以下因素： PAM兼容性：原间隔序列邻近基序 (PAM) 是Cas蛋白识别、结合靶DNA并启动切割过程所必需的。不同的Cas变体识别不同的PAM序列（例如，Cas9使用NGG）。确认您的靶点包含兼容的PAM至关重要。如果您的靶点缺少所需的PAM序列，请考虑使用TALENs来完成您的编辑。TrueDesign Genome Editor 也可为感兴趣的区域设计TALEN对。 靶向活性：sgRNA的效力由其序列、周围DNA环境以及其他特征（如sgRNA:DNA解链温度、折叠间隔序列的最小自由能和染色质可及性）决定。已开发出各种机器学习算法，利用这些因素预测sgRNA的靶向活性。在设计sgRNA以靶向感兴趣区域时，预测的靶向活性得分可以帮助用户选择最佳的sgRNA。在TrueDesign Genome Editor中，我们使用规则集3 [1] 来确定靶向得分。 脱靶活性：在设计过程中，还应评估sgRNA的脱靶图谱。这涉及到扫描感兴趣基因组中具有序列相似性的区域。脱靶搜索应考虑错配，因为Cas9等核酸酶即使存在错配也能使sgRNA结合，从而导致非预期编辑。此外，Cas9识别替代PAM序列，如NAG和NGA，这些也应包含在脱靶分析中，以全面评估潜在的脱靶效应。TrueDesign Genome Editor通过允许sgRNA序列中最多3个错配来评估脱靶位点，并包括带有NGG、NGA和NAG PAM序列的位点。TrueDesign Genome Editor 使用切割频率确定 (CFD) 分数 [2] 对脱靶位点进行评分，并注释脱靶位点的位置，指示其是否位于基因的外显子或内含子中，以及该基因是否是致癌基因或肿瘤抑制基因。这些详细信息可以帮助用户选择脱靶位点数量少、CFD分数低、位于内含子或基因间区域的sgRNA，或这些因素的组合。 与编辑位点的距离：靶序列与所需编辑位点距离的灵活性取决于实验类型。对于敲除实验，理想情况下，sgRNA应设计为靶向基因早期外显子中的序列。对于敲入实验，sgRNA应设计为尽可能接近所需插入位点。除了sgRNA活性外，敲入效率还取决于敲入片段的长度以及插入位点与sgRNA切割位点的距离。对于同源臂较短的插入序列，如果sgRNA切割位点距离插入位点超过10 bp，则敲入效率较低。然而，对于同源臂较长的序列，即使切割位点距离所需插入位点远至40 bp，也能实现更高的效率。 变异重叠：使用参考基因组设计的sgRNA可能由于遗传变异的存在而表现出较低的功效和特异性。遗传变异可能导致PAM位点中断、新PAM位点形成或靶序列中引入错配。因此，在设计sgRNA时，考虑特定目标人群（如果已知）或整体人群的遗传变异非常重要。TrueDesign Genome Editor 使在向导设计过程中可视化遗传变异变得容易，并允许用户进行包含遗传变异的脱靶搜索。 验证sgRNA设计 虽然可以使用多种算法来设计和选择最佳的向导RNA，但功能性测试最终是验证的决定性方法。算法旨在进行预测，但细胞环境和递送方法等因素会显著影响sgRNA的效率。我们建议对您的sgRNA进行功能性测试。 验证是确保sgRNA功能性的关键。在测量sgRNA效率时，拥有适当的阳性、阴性和递送对照至关重要。sgRNA的效率可以通过多种方式测量： 基于T7核酸内切酶的检测：Invitrogen GeneArt基因组切割检测 (GCD) 试剂盒可用于快速、可靠地确认您的sgRNA编辑效率。TrueDesign Genome Editor 为您选择的sgRNA设计GCD引物。 测序：桑格测序或下一代测序可用于确定sgRNA效率以及感兴趣区域编辑的性质。导致移码突变或剪接位点破坏的插入或缺失可能导致基因敲除。如果进行敲入实验，测序可以确认预期模板是否成功插入到所需位置。TrueDesign Genome Editor 还为编辑位点的测序设计引物。 流式细胞术：荧光标记抗体或报告基因可用于验证因基因组编辑而预期出现特定表型变化的细胞中的sgRNA编辑效率。 结论 设计和验证有效的sgRNA对于执行精确高效的CRISPR实验至关重要。遵循建议的sgRNA设计考量和验证步骤有助于确保创建有效的sgRNA。为简化sgRNA的设计，赛默飞世尔科技提供了一个免费平台用于构建sgRNA和基因编辑实验——TrueDesign Genome Editor。这个基因组编辑设计工具整合了sgRNA设计优化的推荐考量，并提供脱靶评估和验证支持，使研究人员能够精确轻松地构建sgRNA。访问thermofisher.com/truedesign了解更多信息。要观看有关如何使用TrueDesign Genome Editor…

质粒DNA 质粒DNA因其克隆、转移和操纵基因的能力而在科学研究中发挥着关键作用。质粒制备尺寸的选择应由所需质粒的数量和质量决定。我们将讨论四种主要制备尺寸，包括质粒小量制备、质粒中量制备、质粒大量制备、质粒兆量制备和质粒吉量制备。我们将简要讨论它们最适合的一些特定研究应用。 五种质粒试剂盒尺寸为：  质粒小量制备 质粒中量制备 质粒大量制备 质粒兆量制备 质粒吉量制备   小量制备试剂盒 质粒DNA小量制备试剂盒广泛用于常规质粒DNA分离，提供了一种快速高效获取少量DNA的方法。与小量制备试剂盒相关的研究应用包括： 筛选文库：小量制备试剂盒非常适合从大型DNA文库中快速分离质粒DNA。研究人员可以获得筛选所需的DNA，并识别感兴趣的特定克隆，从而促进新基因或遗传元件的发现。 测序：小量制备试剂盒为Sanger测序或下一代测序提供模板DNA。研究人员可以获得足够高质量的DNA用于测序应用，从而分析基因序列、遗传变异或突变。 PCR扩增：小量制备试剂盒对于生成PCR扩增所需的模板DNA很有价值。这对于基因表达分析、基因分型和分子诊断等应用至关重要。 质粒小量制备过夜细菌培养体积和产量 培养体积：1 mL –5 mL 近似产量：高达40 µg   中量制备试剂盒 质粒DNA中量制备试剂盒是一种中等质粒制备尺寸，可为各种研究应用提供足够的DNA。与中量制备试剂盒相关的一些常见应用包括： 转染研究：中量制备试剂盒使研究人员能够获得足够量的质粒DNA，用于哺乳动物细胞的高效转染。这对于研究基因功能、蛋白质表达和其他细胞过程至关重要。 基因敲除研究：中量制备试剂盒用于生成敲除构建体，这对于靶向基因破坏实验至关重要。研究人员可以获得所需量的DNA，以引入特定的基因修饰并研究由此产生的表型变化。 分子克隆：中量制备试剂盒对于扩增DNA片段以随后克隆到较大载体中很有价值。这对于构建重组DNA分子和生成用于各种下游应用的DNA片段文库特别有用。 质粒中量制备过夜细菌培养体积和产量 培养体积：25–100 mL 近似产量：高达400 µg   大量制备试剂盒 质粒DNA大量制备试剂盒专为大规模质粒DNA纯化而设计，可为关键研究应用提供高产量的DNA。研究人员通常将大量制备试剂盒用于以下目的： 基因治疗：大量制备试剂盒能够生产大量用于基因递送的治疗性质粒。这些质粒可以携带治疗性基因，通过将功能性基因引入靶细胞来治疗遗传疾病。 疫苗开发：大量制备试剂盒促进质粒的大规模生产，这对于疫苗载体构建至关重要。科学家可以生成大量质粒作为疫苗抗原的载体，有助于开发有效的疫苗。 蛋白质表达：大量制备试剂盒有助于生产高产量的重组蛋白质，用于生化或结构研究。研究人员可以大量表达和纯化感兴趣的蛋白质，从而促进详细的表征和功能分析。 质粒大量制备过夜细菌培养体积和产量 培养体积：100–500 mL 近似产量：高达1.5 mg 兆量制备试剂盒 质粒DNA兆量制备试剂盒专为提供最高产量的质粒DNA而设计。兆量制备试剂盒与质粒DNA吉量制备的应用类似，但处理的体积更大。 大规模生产：兆量制备试剂盒的主要研究应用之一是为工业或商业目的生成大量质粒DNA。生物技术、制药和农业等行业通常需要大量质粒DNA来生产药用蛋白质、抗体、疫苗和工业酶。 基因组编辑：兆量制备试剂盒在制备大量CRISPR-Cas9质粒以实现高效基因组编辑实验方面发挥着关键作用。随着CRISPR-Cas9技术的出现，基因组编辑已成为生物医学研究中强大的工具。兆量制备试剂盒使研究人员能够获得编码CRISPR-Cas9系统所需量的质粒DNA，从而能够大规模精确修饰基因。 合成生物学：兆量制备试剂盒在合成生物学应用所需的大量质粒DNA方面发挥着重要作用。研究人员可以获得大量DNA，用于基因工程中的基因设计和操作。 选择合适的质粒制备尺寸对于成功的科学研究至关重要。大量制备、中量制备、小量制备和吉量制备试剂盒提供独特的优势，并根据不同的研究需求量身定制。了解与每种质粒制备尺寸相关的应用，使研究人员能够优化其实验流程，并获得所需数量的高质量质粒DNA，以进行广泛的科学研究。 如需了解更多信息，请查阅如何自动化质粒DNA纯化或探索可用的众多质粒载体服务。   吉量制备试剂盒 质粒DNA吉量制备试剂盒提供了一种大规模质粒DNA纯化解决方案，可为高级研究应用提供大量DNA。与吉量制备试剂盒相关的一些值得注意的研究应用包括： 大规模生产：吉量制备试剂盒用于为工业或商业目的生成大量质粒DNA。这包括为生物技术应用大规模生产质粒，例如酶生产、生物燃料开发或工业发酵过程。 基因组编辑：吉量制备试剂盒对于制备大量CRISPR-Cas9质粒至关重要，可实现高效的基因组编辑实验。研究人员可以获得所需量的质粒DNA，以引入精确的基因修饰，从而促进基因功能和疾病机制的研究。…

Friends, are you still typing out WeChat Official Account drafts word by word? Now, drop a YouTube video link into n8n, and AI can automatically extract subtitles, refine the text, format it, and even send it directly to your email! Today, I’ll walk you through how to create a fully automated “Video → WeChat Official…

💡 Have you tried using ChatGPT as a parenting consultant? Do you remember the chaotic first time changing a newborn’s diaper? OpenAI CEO Sam Altman admitted in the first OpenAI podcast, “Without ChatGPT, I honestly don’t know how I would have gotten through the first few weeks of fatherhood.” This leading figure in AI is…