即使是最有经验的分子生物学家，在RNA提取过程中也曾忍不住大声咒骂。对于非科学家来说，这可能看起来像是一个可怜的人正在失控，对着一根装满清澈、无名液体的无辜试管大喊大叫。

但对于那些经历过RNA提取诸多困境的科学家来说，很容易产生共鸣。怒气（也被称为“RNA怒”，RNAnger）是处理RNA时自然且常见的副作用。这可以理解：提取产量低和RNA降解即使对资深科学家也可能发生。

从各类样本中获取高质量RNA已成为许多实验方案的基础部分，包括下一代测序（NGS）、定量实时PCR（qRT-PCR）、Northern印迹和cDNA合成，许多科学家 routinely 执行此操作。低质量的RNA会严重影响下游分析，导致时间和金钱的损失。

但情况并非必须如此。许多RNA提取问题都可以避免和克服。为了助您在RNA提取的征程上取得胜利，我们提供了14个技巧，助您将“RNA怒”转化为“RNA智慧”（RNAccumen）。

选择正确的RNA分离试剂盒

市面上有许多用于RNA提取的试剂盒和试剂。但某些方案或形式可能更适合您的目标。请对每种试剂盒或试剂进行仔细研究，并考虑您将从中提取RNA的样本类型、该样本的起始量、您的下游分析方法、所需的通量以及您正在分析的RNA类型。

例如，如果您需要一种高通量的总RNA纯化方法，那么您可能需要考虑可扩展的MagMAX™ 试剂盒，而不是TRIzol RNA提取。但如果您样本量较少，并且想要使用一种高质量RNA的“金标准”方法，您很可能每次都会选择TRIzol。

注意起始样本量

多不总是好。大多数RNA分离试剂盒和试剂都提供了特定样本类型的推荐起始材料量。添加超过推荐量可能会抑制有效的裂解或RNA与其他细胞组分的分离。对于基于柱的方案，您可能会使吸附柱的结合能力过载，从而降低总产量。

请注意，不同动物组织中的RNA含量可能差异很大：心脏和肌肉细胞的总RNA量少于脾脏和胸腺细胞，后者通常富含核酸。这些组织还可能引入其他干扰因素，这可能使提取复杂化，并且可能需要修改方案才能提取高质量的RNA。

创建一个无RNase的环境

RNase？没听说过它们，对吧？

它们是您RNA提取的头号敌人。它们很难被灭活或清除。RNase A家族中的RNase由多个二硫键稳定，即使在变性后也能保持活性。^1,2

为了减少RNA提取过程中RNase意外引入的风险，请创建一个无RNase的操作台圣地。这可以是您工作台的一部分，用胶带划定，与您进行DNA或蛋白质提取的区域分开。将专用于RNA提取工作的试剂、耗材、移液器和手套放在此区域。

穿戴个人防护设备（PPE）

您是RNase的主要来源。您的汗液和皮肤油脂是RNase污染的丰富来源。^3,4因此，戴手套以防止手部污染至关重要。如果您不小心用您戴的手套触摸了可能含有RNase的表面（例如门把手、您的脸部或您创建的无RNase区域以外的其他表面），请务必更换手套。您还可以穿实验服，以确保您的皮肤其他部分不会接触到样本。

使用无RNase的试剂和耗材

与上述观点一致，您还可以购买清洁产品、耗材和其他试剂，这些有助于抑制RNase，确保它们不会靠近您的RNA。表面去污溶液有助于从玻璃器皿、台面和移液器中去除RNase。

您可能会认为所有试管和移液器吸头在开箱时都是无RNase的，但许多在制造过程中可能已经引入了RNase。请确保您的耗材经过无RNase认证，并且您使用带滤芯的吸头，以防止移液器吸头或交叉样本污染。

进行一项预实验

您可能直到开始RNA提取时才意识到某个潜在步骤会让您的RNA暴露于RNase污染，或者您计划使用的试剂盒不适合您的样本类型。为了防止您浪费宝贵的样本，请使用价值较低的样本进行一项预实验，以便您在RNA提取方案中解决问题。这可以节省昂贵的返工成本或重新收集样本的麻烦。

稳定您的RNA

RNA的生化性质使其本质上不稳定，某些RNA的半衰期很短。^5,6为了确保您不会对下游分析造成偏差，您需要在样本收集后尽快破坏所有内源性RNase。您可以通过使用TRIzol或我们PureLink™ RNA微量试剂盒中的裂解缓冲液裂解细胞，并将样本在-80°C下冷冻以备后续处理。您也可以在裂解缓冲液中重悬后立即提取RNA。此外，在液氮中快速冷冻样本可以防止样本收集后的RNA降解。

如果您不想处理液氮的麻烦，可以使用RNA稳定试剂，例如RNAlater。它能立即灭活RNase，让您在有时间的时候灵活地提取RNA，无需担心RNA降解。

添加机械或酶裂解步骤

FFPE样本、血液样本和某些微生物是出了名的难以从中提取足够量高质量RNA的样本，可能需要额外步骤以确保完全裂解。这些步骤可能包括使用珠磨的机械裂解或使用溶菌酶或蛋白酶K的酶预处理。如前所述，不完全裂解可能会导致基于柱的提取方法出现下游问题。在从难处理样本中提取RNA之前，请仔细查阅方案，看它们是否包含针对难处理样本的特定方案步骤。

保持低温

RNA的不稳定性使得在整个处理过程中保持样本低温至关重要。如果您之前遇到过RNase问题，可以考虑将提取溶液保持低温，在冷藏室中进行提取，或使用预冷离心机进行离心步骤。

去除DNA污染

大多数RNA分离试剂盒和试剂都能有效去除污染的基因组或质粒DNA。但某些下游定量方法，例如NanoDrop，或应用，例如qRT-PCR，即使微量的DNA也能检测到，从而使分析复杂化。

为了纠正这个问题，许多基于柱的纯化方法都包含DNase I，例如PureLink™ DNase试剂盒，它可用于柱上处理。您也可以使用DNase I进行提取后消化。

RNA定量和质量控制

有几种方法可以对纯化的RNA进行质量控制并获得准确的定量结果。您可以使用260nm（核酸）、280nm（污染蛋白）和230nm（其他污染物，如异硫氰酸胍）波长的紫外吸收。RNA纯度可以通过查看A260 / A280比值（目标在1.8至2.2之间）和A260 / A230比值（目标>1.7）来估算。

荧光计，例如Qubit荧光计，也可以对RNA进行定量，并且比基于紫外吸收的方法更灵敏。微流控方法也有助于RNA定量和质量测定。样本用荧光染料标记，并通过凝胶基质电泳。不同的RNA种类根据大小在基质中迁移，通过观察完整的荧光轨迹可以估算RNA的完整性。该方法可以检测DNA污染物或RNA降解产物，并将其转化为1到10的RNA完整性数字（RIN），其中10表示最佳RNA完整性。

储存纯化的RNA

许多基于柱或磁珠的试剂盒都提供无RNase的洗脱缓冲液，可以长期保护RNA的完整性。对于TRIzol RNA提取，您可以将干燥的沉淀重悬于无RNase的水或其他特殊储存溶液中。定量后，将您的RNA分装到一次性试管中，这样可以最大程度地减少冻融循环（可能导致降解）或意外的RNase污染。如果您打算短期使用RNA，请将其储存在-20°C。否则，将其储存在-80°C以进行长期储存。

自动化提取

一些可用的RNA提取试剂盒（包括前面提到的MagMAX试剂盒）可以与自动化提取和纯化系统配合使用，例如KingFisher™。自动化有助于避免RNA提取的一个主要问题——来自人类接触的RNase污染。与手动样本制备相比，它还能实现可重复的RNA纯化，并将手动操作时间减少75%。

让您的RNA提取每一步都轻松搞定

寻求帮助

有些问题太大了，我们无法独自解决。如果您在RNA提取方面需要额外的支持和帮助，请访问我们的RNA样本收集、保护和分离支持中心。那里有指南、基本教程、故障排除技巧、培训等等，可帮助您走上成功的RNA提取之路。

要继续您的学习，我们还有其他在线资源：

• RNA参考指南
• RNA分离的注意事项
• PureLink试剂盒与Qiagen试剂盒应用说明

本文仅供研究使用。不可用于诊断程序。

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参考文献

1. RNA操作：基础知识。赛默飞世尔科技网站： https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FBID%2FTechnical-Notes%2Frnasezap-rnase-decontamination-solution-tech-note.pdf&title=VGVjaCBOb3RlOiBSTmFzZVphcCBSTmFzZSBEZWNvbnRhbWluYXRpb24gU29sdXRpb24uIFdvcmtpbmcgd2l0aCBSTkE6IHRoZSBiYXNpY3M=。发布日期：2019年5月2日。访问日期：2021年7月26日。
2. Klink TA, Woycechowsky KJ, Taylor KM, Raines RT. 二硫键对核糖核酸酶A构象稳定性和催化活性的贡献。 Eur J Biochem. 2000;267:566-572.
3. Gupta SK, Haigh BJ, Griffin FJ, Wheeler TT. 哺乳动物分泌型RNase：在宿主防御中的作用机制。 Innate Immun. 2013;19:86-97.
4. Zasloff M. 人类皮肤的抗菌RNase。 J Invest Dermatol. 2009;129:2091-2093.
5. RNA。EMBL-EBI网站： https://www.ebi.ac.uk/training/online/courses/biomacromolecular-structures/rna/。访问日期：2021年7月28日。
6. Sharova LV, Sharov AA, Nedorezov T, Piao Y, Shaik N, Ko MS. 通过多能性和分化小鼠胚胎干细胞的DNA微阵列分析获得的19 977个基因的mRNA半衰期数据库。 DNA Res. 2009

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