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设计有效的CRISPR实验涉及多个步骤，其中之一是单向导RNA (sgRNA) 的有效设计。sgRNA是可编程序列，引导核酸酶（如CRISPR-Cas9）到达特定的DNA靶点。高效的sgRNA设计对于执行精确的基因组编辑实验至关重要。

为什么sgRNA设计很重要？

为了优化sgRNA设计，应考虑以下因素：

1. PAM兼容性：原间隔序列邻近基序 (PAM) 是Cas蛋白识别、结合靶DNA并启动切割过程所必需的。不同的Cas变体识别不同的PAM序列（例如，Cas9使用NGG）。确认您的靶点包含兼容的PAM至关重要。如果您的靶点缺少所需的PAM序列，请考虑使用TALENs来完成您的编辑。TrueDesign Genome Editor 也可为感兴趣的区域设计TALEN对。
2. 靶向活性：sgRNA的效力由其序列、周围DNA环境以及其他特征（如sgRNA:DNA解链温度、折叠间隔序列的最小自由能和染色质可及性）决定。已开发出各种机器学习算法，利用这些因素预测sgRNA的靶向活性。在设计sgRNA以靶向感兴趣区域时，预测的靶向活性得分可以帮助用户选择最佳的sgRNA。在TrueDesign Genome Editor中，我们使用规则集3 [1] 来确定靶向得分。
3. 脱靶活性：在设计过程中，还应评估sgRNA的脱靶图谱。这涉及到扫描感兴趣基因组中具有序列相似性的区域。脱靶搜索应考虑错配，因为Cas9等核酸酶即使存在错配也能使sgRNA结合，从而导致非预期编辑。此外，Cas9识别替代PAM序列，如NAG和NGA，这些也应包含在脱靶分析中，以全面评估潜在的脱靶效应。TrueDesign Genome Editor通过允许sgRNA序列中最多3个错配来评估脱靶位点，并包括带有NGG、NGA和NAG PAM序列的位点。TrueDesign Genome Editor 使用切割频率确定 (CFD) 分数 [2] 对脱靶位点进行评分，并注释脱靶位点的位置，指示其是否位于基因的外显子或内含子中，以及该基因是否是致癌基因或肿瘤抑制基因。这些详细信息可以帮助用户选择脱靶位点数量少、CFD分数低、位于内含子或基因间区域的sgRNA，或这些因素的组合。
4. 与编辑位点的距离：靶序列与所需编辑位点距离的灵活性取决于实验类型。对于敲除实验，理想情况下，sgRNA应设计为靶向基因早期外显子中的序列。对于敲入实验，sgRNA应设计为尽可能接近所需插入位点。除了sgRNA活性外，敲入效率还取决于敲入片段的长度以及插入位点与sgRNA切割位点的距离。对于同源臂较短的插入序列，如果sgRNA切割位点距离插入位点超过10 bp，则敲入效率较低。然而，对于同源臂较长的序列，即使切割位点距离所需插入位点远至40 bp，也能实现更高的效率。
5. 变异重叠：使用参考基因组设计的sgRNA可能由于遗传变异的存在而表现出较低的功效和特异性。遗传变异可能导致PAM位点中断、新PAM位点形成或靶序列中引入错配。因此，在设计sgRNA时，考虑特定目标人群（如果已知）或整体人群的遗传变异非常重要。TrueDesign Genome Editor 使在向导设计过程中可视化遗传变异变得容易，并允许用户进行包含遗传变异的脱靶搜索。

验证sgRNA设计

虽然可以使用多种算法来设计和选择最佳的向导RNA，但功能性测试最终是验证的决定性方法。算法旨在进行预测，但细胞环境和递送方法等因素会显著影响sgRNA的效率。我们建议对您的sgRNA进行功能性测试。

验证是确保sgRNA功能性的关键。在测量sgRNA效率时，拥有适当的阳性、阴性和递送对照至关重要。sgRNA的效率可以通过多种方式测量：

1. 基于T7核酸内切酶的检测：Invitrogen GeneArt基因组切割检测 (GCD) 试剂盒可用于快速、可靠地确认您的sgRNA编辑效率。TrueDesign Genome Editor 为您选择的sgRNA设计GCD引物。
2. 测序：桑格测序或下一代测序可用于确定sgRNA效率以及感兴趣区域编辑的性质。导致移码突变或剪接位点破坏的插入或缺失可能导致基因敲除。如果进行敲入实验，测序可以确认预期模板是否成功插入到所需位置。TrueDesign Genome Editor 还为编辑位点的测序设计引物。
3. 流式细胞术：荧光标记抗体或报告基因可用于验证因基因组编辑而预期出现特定表型变化的细胞中的sgRNA编辑效率。

结论

设计和验证有效的sgRNA对于执行精确高效的CRISPR实验至关重要。遵循建议的sgRNA设计考量和验证步骤有助于确保创建有效的sgRNA。为简化sgRNA的设计，赛默飞世尔科技提供了一个免费平台用于构建sgRNA和基因编辑实验——TrueDesign Genome Editor。这个基因组编辑设计工具整合了sgRNA设计优化的推荐考量，并提供脱靶评估和验证支持，使研究人员能够精确轻松地构建sgRNA。访问thermofisher.com/truedesign了解更多信息。要观看有关如何使用TrueDesign Genome Editor 的视频，请在此处探索播放列表。

仅供研究使用。不可用于诊断程序。

参考文献

[1] DeWeirdt, P. C., et al. (2022)。考虑tracrRNA序列的微小变异可改善CRISPR筛选的sgRNA活性预测。《自然生物技术》，*40*(4)，570-578页。https://doi.org/10.1038/s41587-021-01107-5

[2] Doench, J. G., et al. (2016)。优化sgRNA设计以最大化CRISPR-Cas9的活性并最小化脱靶效应。《自然生物技术》，*34*(2)，184-191页。https://doi.org/10.1038/nbt.3437